INTRODUCCIÓNHígado graso no alcohólico    La enfermedad del hígado graso no alcohólico (HGNA) afecta  a cerca del 30% de la población adulta, convirtiéndose en un problema relevante de salud pública (\citealt{Arrese_2010}, \citealt{24552858}). Histológicamente, el HGNA engloba un espectro de condiciones diferentes que abarcan, desde la esteatosis simple, caracterizada por la acumulación de grasa en el hígado hasta la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA)  caracterizada por la presencia de fenómenos necroinflamatorios en el hígado (\citealt{Arrese_2010}, \citealt{24552858}). Hasta ahora, no existe claridad del por qué solo algunos pacientes, entre un 5 a un 20%, puede progresar a EHNA, sin existir en la actualidad una terapia efectiva para esta condición (\citealt{Jahn_2016}).   Más aun, la EHNA es la puerta de entrada a patologías hepáticas más severas como la cirrosis y el cáncer hepático, siendo por ello considerada como un fuerte predictor de la alta tasa de mortalidad de pacientes con HGNA \cite{Angulo_2015}.     La patogénesis del HGNA involucra en primer lugar la acumulación de triglicéridos como gotas lipídicas en los hepatocitos, atribuido al aumento de la lipólisis desde el tejido adiposo viceral/subcutáneo y/o aumento de la ingesta diaria de grasa lo cual incrementa la captura de ácidos grasos libres (AGL) por el hígado \cite{Browning_2004}. Además, el desarrollo de esteatosis hepática también es consecuencia de la disminución de la oxidación de los ácidos grasos, aumento de la lipogénesis de novo hepática junto a la disminución de la secreción de lipoproteína de baja densidad (LDL)-trigliceridos \cite{Fabbrini_2008}. A pesar que éste proceso es considerado benigno en la mayoría de los pacientes, debido a que la acumulación de grasa en el hígado solo sería una respuesta adaptativa y fisiológica \cite{Yamaguchi_2007,Unger_2010},  la progresiva exposición a los AGL sería el primer paso para el desarrollo de daño hepatocelular, inflamación y apoptosis \cite{Feldstein_2004}.    Diversos estudios han descrito que los lípidos acumulados promueven la activación de mecanismos de lipotoxicidad en el hígado siendo uno de los posibles gatillantes  del desarrollo de EHNA  \cite{Malhi_2006,Kakisaka_2011}. Sin embargo, existe una teoría que propone que la transición o el desarrollo de EHNA dependería de un segundo evento (isquemia, fármacos, daño inducido por endotoxina, etc)  para que las señales de inflamación  persistan en el tiempo \cite{Larter_2010}. Esta teoría explicaría que el  aumento de las señales inflamatorias  es el resultado de la exposición constante de los hepatocitos a los AGL dejándolos susceptibles al daño, y que un segundo evento promevería la transición de la esteatosis a la EHNA  \cite{Larter_2010}. La evidencia se basa en estudios in vitro en donde cultivos celulares de hepatocitos cargados con grasa (hepatocitos esteatóticos) presentan un aumento de marcadores de estrés intracelular junto a un aumento de la  muerte celular de los hepatocitos \cite{Feldstein_2003}. Además se describe que ésta respuesta celular  es persistente en el tiempo debido a la acción autocrina y paracrina de macrófagos residentes del hígado (células de kupffer) y de las células estrelladas hepáticas que activan las vías inflamatorias y fibrogénicas respectivamente \cite{Feldstein_2003}. Estudios recientes han demostrado que los hepatocitos esteatóticos activaría distintos mecanismos moleculares de disfunción hepatocelular que actuarían como un segundo evento que promueven el aumento de marcadores de inflamación tales como estrés oxidativo, disfunción mitocondrial, activación de caspasas proapoptóticas, entre otros \cite{P_rez_Carreras_2003,Akazawa_2013,Upton_2012}. Más aun,  éste daño hepatocelular mediaría la activación  de células de kupffer y células estrelladas amplificando de éste modo las cascadas inflamatorias y fibrogénicas que podrían explicar cómo de una simple esteatosis se desencadena la EHNA. Por lo tanto,  a pesar de éstos hallazgo, queda aun por dilucidar los mecanismos celulares involucrados en la transición de la esteatosis simple a EHNA.Síndrome de la apnea obstructiva del sueño y su relación con HGNA     En la búsqueda de nuevos antecedentes que contribuyan a responder la pregunta ¿Por qué solo algunos pacientes con HGNA progresan a una forma más agresiva de la enfermadad como la EHNA?, es que observaciones clínicas han mostrado que tanto pacientes obesos como normopeso que además poseen síndrome de la apnea obstructiva del sueño (SAOS) presentan mayor riesgo de padecer una condición más grave de  HGNA asociado a niveles elevados en el plasma de marcadores de daño hepático \cite{Gude_2009,Shpirer_2010}. La fisiopatología de este cuadro se caracteriza por la obstrucción intermitente de la vía aérea que altera el intercambio gaseoso resultando en episodios repetitivos de hipoxemia (caída en la saturación arterial de oxígeno)  denominada hipoxia intermitente crónica (HIC) \cite{Mirrakhimov_2012}. La evidencia experimental ha demostrado que la HIC induce daño hepatocelular, inflamación y fibrosis gatillando la evolución desde el HGNA a EHNA (AC). Un estudio reciente realizado en pacientes no obesos con SAOS, demostró que dichos individuos exhiben a nivel histológico un aumento de marcadores de fibrosis e inflamación que se  correlaciona con el grado de severidad del SAOS \cite{24256086}.  Más aun, un estudio in vitro reveló que la condición de hipoxia en hepatocitos desencadena la disminución de la β-oxidación de los ácidos grasos y aumento de la lipogénesis  de novo, promoviendo la acumulación de lípidos y por ende explicando la mayor predisposición de hígado graso en éste contexto de hipoxia y SAOS \cite{Liu_2014}. Otros estudios clínicos, y estudios en  modelos in vivo en los que se ha imitado la HIC, sugieren que en el contexto del SAOS, el daño hepatocelular y la inflamación hepática podrían ser de mayor magnitud a través de un mecanismo fisiológico mediado por la inducción a nivel hepático del factor 1α inducible por hipoxia (HIF-1α) \cite{Mirrakhimov_2012,Jun_2008}. En base a ello, estudios in vitro han demostrado que HIF-1α sería determinante en la activación de moduladores de inflamación y fibrosis hepática, lo cual podría ser clave para el desarrollo y  progresión del daño en  la EHNA  \cite{Jun_2008,Copple_2010,Moon_2009}. El mecanismo del cómo HIF-1α sensa los niveles de oxígeno intracelulares se debe a que éste factor posee una subunidad sensible al oxígeno, y  que a su vez es regulada por la degradación constante que depende de la acción enzimática de las prolil hidroxilasas para la posterior degradación proteasomal \cite{WENGER_2002}. Por lo tanto, cuando la concentración de oxígeno es baja, la hidroxilación no se lleva a cabo y HIF se estabiliza y transloca al núcleo para activar los genes diana por medio de la unión de HIF a los elementos que responden a hipoxia (HREs) situados en los promotores \cite{Kim_2006}.    Por lo tanto, estos antecedentes revelan que la HIC en el contexto de SAOS estaría involucrada en la transición de una simple esteatosis a una condición más lipotóxica,  inflamatoria y/o fibrótica, siendo considerada como un evento más para inducir EHNA.Microvesículas extracelulares y su rol en la patogénesis del EHNA     Como se ha descrito anteriormente  en el contexto del desarrollo de la EHNA, los hepatocitos esteatóticos al presentar lipotoxicidad liberarían diversas señales de daño al ambiente promoviendo el desarrollo de la patogénesis molecular de la EHNA que depende de otros tipos celulares como las células de kupffer y células estrelladas \cite{Povero_2014}. Diversos estudios han identificado como posibles señales moleculares de daño a las vesículas extracelulares (EVs) o exovesículas \cite{Arrese_2015}. Las EVs son pequeñas estructuras rodeadas de membrana y que se liberan desde las células al medio extracelular cumpliendo funciones fisiológicamente normales o estar involucradas en la fisiopatología de alguna enfermedad \cite{Colombo_2014}. Las EVs pueden actuar en otras células diana tanto de forma autocrina, paracrina e inclusive de forma endocrina \cite{Eguchi_2015}. Se sabe que el hígado es un productor y receptor de EVs, y que en modelos in vivo de daño hepático  se presenta un aumento de EVs en el plasma \cite{Povero_2014,Arrese_2015}.    Existen distintos tipos de EVs; los exosomas (50-100 nm) liberados de cuerpos multivesiculares, las micropartículas o microvesículas (100-1000 nm) liberadas de brotación de la membrana plasmática y los cuerpos apoptóticos (> 1000 nm) \cite{Raposo_2013}. En general, las EVs pueden contener proteínas, lípidos, DNA y RNA tanto codificante como no codificante \cite{Raposo_2013}. Recientes estudios han indicado que a través de exosomas, los hepatocitos logran comunicarse con otros tipos celulares activando señales de inflamación, fibrosis e incluso de carcinogénesis \cite{Arrese_2015,Eguchi_2015}. Un ejemplo de ello quedó revelado en un estudio  in vitro en donde se determinó que la activación de señales inflamatorias en macrófagos depende de los  exosomas  liberados de hepatocitos esteatóticos \cite{Hirsova_2016}. Otros estudios in vivo han determinados que el aumento de EVs se correlaciona con la temporalidad del daño  en EHNA, por lo que funcionarían como biomarcadores de ésta patología con un potencial en el diagnostico no invasivo \cite{Povero_2015,Kornek_2012}.     Por lo tanto, la progresión del daño en HGNA depende de una serie de eventos concomitantes que requieren de la activación de señales de inflamación y/o fibrosis en el hígado y que no se explica solamente por la acumulación de lípidos en los hepatocitos y el efecto lipotóxico. Es por ello, que se propone  que en el contexto de hipoxia, las EVs juegan un rol importante en la promoción de una respuesta celular exacerbada frente a la lipotoxicidad, amplificando paracrinamente los procesos de inflamación y /o fibrosis en otros tipos de células como las de kupffer y estrelladas,  que determinarían el desarrollo de EHNA.HIPOTESIS     La hipoxia induce activación de células de kupffer y células estrelladas hepáticas a través de EVs (exosomas) liberadas por hepatocitos esteatóticos.OBJETIVO GENERAL    Evaluar si la hipoxia promueve la liberación de las EVs  desde hepatocitos esteatóticos  amplificando las señales inflamatorias y de fibrosis en células de kupffer y células estrelladas hepáticas respectivamente.Objetivos específicos    1) Evaluar si hipoxia aumenta la liberación de EVs en un modelo  de EHNA  experimental→ Se evaluará en un modelo in vivo de hipoxia intermitente crónica y dietético para la inducción de EHNA→ Se evaluará en un modelo in vitro de hipoxia química con CoCl2 o con un inhibidor de la prolil hidroxilasa en hepatocitos cargados con AGL para la inducción de esteatosis y lipotoxicidad     2) Evaluar si las EVs desde hepatocitos esteatóticos en condición de hipoxia activan a las células de kupffer promoviendo señales inflamatorias.    3) Evaluar si las EVs desde hepatocitos esteatóticos en condición de hipoxia activan a las células estrelladas promoviendo señales profibróticas.Estrategia ExperimentalTodo el estudio con uso experimental y cuidado de todos los animales serán revisados y aprobados por el  Comité de ética y bienestar Animal (CEBA) de la Escuela de Medicina, Pontificia Universidad Católica de Chile.1. Para evaluar si hipoxia aumenta la liberación de EVs en un modelo  de EHNA  experimental: Modelo in vivoVeinticuatro ratones machos C57BL/6 (edad 12 semanas) serán adquiridos de Jackson Laboratories . Los ratones serán divididos al azar en 4 grupos experimentales (n=6/Grupo). Doce animales recibirán dieta deficiente en el aminoácido colina (CDAA) para inducir la EHNA por 22 semanas (Grupo CDAA), de los cuales seis serán sometidos a hipoxia intermitente crónica (HIC) las últimas 10 semanas (Grupo CDAA + HIC). Doce animales recibirán dieta Chow o normal (Grupo Control), de los cuales seis serán sometidos a hipoxia intermitente crónica (HIC) las últimas 10 semanas (Grupo CHI). Cada grupo de animales se alojará en jaulas de policarbonato transparente sometidos a ciclos de 12 h de luz/oscuridad, bajo una temperatura de 21°C y una humedad relativa del 50%. Después de las 22 semanas de completado el experimento, los ratones se sacrificarán por exanguinación bajo anestesia profunda intraperitonial (ketamina 60 mg/kg con xilacina 10 mg/kg) , y muestras de sangre, orina e hígado se recolectarán y almacenarán a -80°C hasta su análisis. Para determinar la función hepática de los cuatro grupos, por medio del plasma recolectado se cuantificará la transaminasa glutámico-pirúvica (GPT) a través de un kit comercial  de Kovalent Ltd. y el contenido de triglicéridos hepático (HTC) se evaluará usando un kit comercial para mediciones en sangre.  Para analizar el grado de esteatosis, balonización, inflamación y fibrosis y obtener el NAS (NAFLD activity score) de cada uno de los grupos se utilizarán las secciones  de hígado obtenidas de todos los  animales. Se realizará cortes histológicos de cada una de las muestras, los cuales serán teñidos con distintas soluciones: Hematoxilina/Eosina (HE) para evaluar morfología y esteatosis junto a Oil Red para la detección de las gotas lipídicas  y Sirius Red 0,1% para evaluar fibrosis a través de la tinción del colágeno total. Para el cálculo del NAS todas las imágenes serán evaluadas por un examinador ciego.Para evaluar el aumento de marcadores de inflamación y fibrosis, se extraerá RNA total desde cada una de las muestras de hígado obtenida de todos los animales para el posterior análisis génico a través de la técnica de RT-qPCR. Los genes a cuantificar serán los correspondientes a marcadores de inflamación: IL-1β, IL-6, IL-18, TNF-α, IFNγ y caspasa-1; y marcadores de fibrosis; Colágeno1A, αSMA, MMP-2, TGF-β y CTGF. Además, se evaluará la expresión proteica desde cada una de las muestras de hígado obtenida de todos los animales de HIF-1α, Colágeno-I α2 y Caspasa-1 a través de la técnica de Western Blot.Finalmente, la liberación de las EVs se evaluará en plasma y orina recolectada de cada uno de los animales por ultracentrifugación diferencial a realizarse en el Laboratorio de Endocrinología en colaboración con el Dr. Cristián Carvajal. realizarse en el Laboratorio de Endocrinología en colaboración con el Dr. Cristián CarLas EVs obtenidas serán cuántificadas y caracterizadas mediante la detección proteica por Western Blot de los distintos marcadores de la superficie de las EVs provinientes de hepatocitos tales como LAMP1, CD63, TSG101, ARF6 y ASGPR1.Posibles problemas del modelo. 1. Se considerará el uso de otras dietas para la inducción de la EHNA en el caso que el daño hepático no sea el que se espera respecto a la histología y los parámetros evaluados en sangre que miden función hepática. Las alternativas son el uso de la dieta  deficiente en metionina y colina (MCD), que a diferencia de la CDAA, se requiere de menor tiempo para la inducción de la EHNA (8 a 10 semanas), o el uso de la dieta alta en grasa (HFD) que presenta una duración similar a la de la CDAA.2. Existe variada evidencia respecto a la  duración de la  inducción de la HCI en ratones \cite{Savransky_2007,Drager_2011}, desde 4 a 24 semanas de inducción. Es por ello, que se considerará como alternativa un mayor tiempo de inducción de la HCI (mayor a 10 semanas) en el caso que no se presente la estabilización de HIF-1α (detectada en hígado), cambios significativos en los parámetros de función hepática y de cantidad de las EVs a evaluar entre los grupos con HIC y grupo Control con o sin CDAA. Se estimará además evaluar los niveles de eritropoyetina (EPO) en sangre como control positivo del efecto de la hipoxia durante las primeras semanas de la inducción en los animales.Modelo in vitroSe utilizará la línea celular HuH-7 provenientes de células de carcinoma hepatocelular humana. Las células HuH-7 se sembrarán en placas de 6 pocillos (para la extracción de RNA total y proteínas) y en flasks de 75 cm2 (para la obtención del medio celular y de las EVs). Para la inducción química de hipoxia las células serán incubadas durante 24 horas con 200 μM de Cloruro (II) de Cobalto hexahidratado (Grupo CoCl2) y alternativamente otro grupo de células se les inducirá hipoxia a través del tratamiento con 30 μM de FG-4497 que corresponde a un inhibidor de la prolil-hidroxilasa (Grupo iPHD). Las células sin tratamiento de CoCl2 o FG-4497 corresponden al Grupo Control. Para la inducción de esteatosis y lipotoxicidad,   las células se tratarán con una mezcla 2:1 de los ácidos grasos libres (AGL) ácido oleico (AO) 500 μM y ácido palmítico (AP) 250 μM. Se incubarán las células con los AGL (Grupo AGL) o coincubarán con CoCl2 (Grupo AGL+ CoCl2)  o con  FG-4497 (Grupo AGL + iPHD) por 24 horas. Se realizará 5 repeticiones con los distintos tratamientos  para obtener n=5.Por una parte, los hepatocitos esteatóticos, tras el tratamiento con los AGL, se caracterizan por un aumento en la formación de gotas lipídicas. Esto será evaluado utilizando el reactivo Nile Red que tiñe las gotas lipídicas de color rojo, pudiendo ser analizadas en un microscopio de fluorescencia. Por otra parte, los hepatocitos con inducción de hipoxia, con CoCl2 o FG-4497,  se caracterizan por estabilizar el factor 1α inducible por hipoxia (HIF-1α). Para comprobar la efectividad de la estabilización se cuantificarán los niveles proteicos de HIF-1α analizados por medio de Western Blot. Se determinará cambios en los marcadores génicos pro-inflamatorios (IL-1β, IL-6, IL-18, TNF-α e iNOS) y pro-fibróticos (Colágeno1A,(Colágeno1A,e αSMA,αSMA,cadacada MMP-2,MMP-2,unouno PDGF,PDGF,dede TGF-βTGF-βloslos yygruposgrupos CTGF)CTGF)porpor enmediomedio cadadede unoRT-qPCR.RT-qPCR. de todos los grupos experimentales por medio de RT-qPCR. Para todos los tratamientos en las células HuH-7, se realizará ensayo viabilidad con el reactivo MTS, en el cual se espera que ninguna de las condiciones afecte el número de células metabólicamente activas ya que de lo contrario indicaría un aumento de la muerte celular.La liberación de las EVs provinientes de las células HuH-7 serán aisladas a partir de un mínimo de 70 mL de medio de cultivo celular una vez finalizada las 24 horas de cada uno de los tratamientos por ultracentrifugación diferencial. Este medio de cultivo puede ser congelado a -80ºC por un periodo de un mes antes de su análisis, el cual se realizará en el Laboratorio de Endocrinología en colaboración con el Dr. Cristián Carvajal.  Las EVs obtenidas serán cuantificadas y caracterizadas mediante la detección proteica por Western Blot de los distintos marcadores de la superficie de las EVs provinientes de hepatocitos, usando anticuerpos específicos para LAMP1, CD63, TSG101, ARF6 y ASGPR1.Posibles problemas del modelo. 1. Las líneas celulares de hepatocitos como HuH-7 suelen responder a diferentes tratamientos de la misma forma que un cultivo primario de hepatocitos. Si no se presentan cambios significativos en la expresión de los distintos marcadores pro-inflamatorios, pro-fibróticos y en la liberación de las EVs con el tratamiento de los distintos estabilizadores de HIF-1 en las células HuH-7 esteatóticas, se optará por repetir todos los experimentos usando cultivo primario de hepatocitos a partir de ratones machos C57BL/6.   2) Evaluar si las EVs desde hepatocitos esteatóticos en condición de hipoxia activan a las células de kupffer promoviendo señales inflamatorias.Para comprobar si las EVs desde los hepatocitos esteatóticos con y sin inducción de hipoxia, por medio de los distintos estabilizadores de HIF-1α, tienen un efecto activador de los macrófagos residentes en el hígado (células de Kupffer o KC) se realizará un cultivo primario de éste tipo celular a partir de ratones machos C57BL/6 a realizarse en el laboratorio de gastroenterología de la Universidad de  Groningen en colaboración con el equipo del Dr. Han Moshage.  Una vez obtenido el cultivo primario de las KC, la activación de las células será evaluada a partir del tratamiento de ellas con medio condicionado y con las EVs aisladas desde células HuH-7 previamente tratadas por 24 horas.   Posteriormente, se analizará a nivel génico y proteico por RT-qPCR y Western Blot respectivamente la activación pro-inflamatoria de las KC a través de la cuantificación de los siguientes marcadores: IL-1β, IL-6, IL-18, TNF-α e iNOS. Se realizará 5 repeticiones con los distintos tratamientos (medio condicionado y EVs aisladas de las células HuH-7) en las KC para obtener n=5.     3) Evaluar si las EVs desde hepatocitos esteatóticos en condición de hipoxia activan a las células estrelladas promoviendo señales profibróticas.Para comprobar si las EVs desde los hepatocitos esteatóticos con y sin inducción de hipoxia, por medio de los distintos estabilizadores de HIF-1α, tienen un efecto activador de las células estrelladas en el hígado (HSC) se realizará un cultivo primario de éste tipo celular a partir de ratones machos C57BL/6 a realizarse en el laboratorio de gastroenterología de la Universidad de  Groningen en colaboración con el equipo del Dr. Han Moshage.  Una vez obtenido el cultivo primario de las HSC, la activación de las células será evaluada a partir del tratamiento de ellas con medio condicionado y con las EVs aisladas desde células HuH-7 previamente tratadas por 24 horas.   Posteriormente, se analizará a nivel génico y proteico por RT-qPCR y Western Blot respectivamente la activación pro-fibrótica de las HSC a través de la cuantificación de los siguientes marcadores: Colágeno1A, αSMA, MMP-2, PDGF, TGF-β y CTGF. Se realizará 5 repeticiones con los distintos tratamientos (medio condicionado y EVs aisladas de las células HuH-7) en las HSC para obtener n=5.