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\begin{document}

\title{Proyecto Tesis Doctoral~}



\author[1]{anhernan}%
\author[2]{Daniel Cabrera}%
\author[1]{marrese}%
\affil[1]{Affiliation not available}%
\affil[2]{Pontifical Catholic University of Chile}%


\vspace{-1em}



  
  \date{May 04, 2024}


\begingroup
\let\center\flushleft
\let\endcenter\endflushleft
\maketitle
\endgroup








\sloppy


\selectlanguage{ngerman}\textbf{INTRODUCCIÓN}

\textbf{Hígado graso no alcohólico}

~~~~La enfermedad del hígado graso no alcohólico (HGNA) afecta~ a cerca
del 30\% de la población adulta, convirtiéndose en un problema relevante
de salud pública (\citealt{Arrese_2010},~\citealt{24552858}).
Histológicamente, el HGNA engloba un espectro de condiciones diferentes
que abarcan, desde la esteatosis simple, caracterizada por la
acumulación de grasa en el hígado hasta la esteatohepatitis no
alcohólica (EHNA) ~caracterizada por la presencia de fenómenos
necroinflamatorios en el hígado
(\citealt{Arrese_2010},~\citealt{24552858}). Hasta ahora, no existe
claridad del por qué solo algunos pacientes, entre un 5 a un 20\%, puede
progresar a EHNA, sin existir en la actualidad una terapia efectiva para
esta condición (\citealt{Jahn_2016}).~~ Más aun, la EHNA es la puerta de
entrada a patologías hepáticas más severas como la cirrosis y el cáncer
hepático, siendo por ello considerada como un fuerte predictor de la
alta tasa de mortalidad de pacientes con HGNA \cite{Angulo_2015}.

~~~~ La patogénesis del HGNA involucra en primer lugar la acumulación de
triglicéridos como gotas lipídicas en los hepatocitos, atribuido al
aumento de la lipólisis desde el tejido adiposo viceral/subcutáneo y/o
aumento de la ingesta diaria de grasa lo cual incrementa la captura de
ácidos grasos libres (AGL) por el hígado~\cite{Browning_2004}. Además, el
desarrollo de esteatosis hepática también es consecuencia de la
disminución de la oxidación de los ácidos grasos, aumento de la
lipogénesis de novo hepática junto a la disminución de la secreción de
lipoproteína de baja densidad (LDL)-trigliceridos~\cite{Fabbrini_2008}. A
pesar que éste proceso es considerado benigno en la mayoría de los
pacientes, debido a que la acumulación de grasa en el hígado solo sería
una respuesta adaptativa y fisiológica~\cite{Yamaguchi_2007,Unger_2010},~ la
progresiva exposición a los AGL sería el primer paso para el desarrollo
de daño hepatocelular, inflamación y apoptosis~\cite{Feldstein_2004}.

~~~~Diversos estudios han descrito que los lípidos acumulados promueven
la activación de mecanismos de lipotoxicidad en el hígado siendo uno de
los posibles gatillantes~ del desarrollo de EHNA ~\cite{Malhi_2006,Kakisaka_2011}.
Sin embargo, existe una teoría que propone que la transición o el
desarrollo de EHNA dependería de un segundo evento (isquemia, fármacos,
daño inducido por endotoxina, etc)~ para que las señales de inflamación
~persistan en el tiempo~\cite{Larter_2010}. Esta teoría explicaría que
el~ aumento de las señales inflamatorias~ es el resultado de la
exposición constante de los hepatocitos a los AGL dejándolos
susceptibles al daño, y que un segundo evento promevería la transición
de la esteatosis a la EHNA ~\cite{Larter_2010}. La evidencia se basa en
estudios in vitro en donde cultivos celulares de hepatocitos cargados
con grasa (hepatocitos esteatóticos) presentan un aumento de marcadores
de estrés intracelular junto a un aumento de la~ muerte celular de los
hepatocitos~\cite{Feldstein_2003}. Además se describe que ésta respuesta
celular ~es persistente en el tiempo debido a la acción autocrina y
paracrina de macrófagos residentes del hígado (células de kupffer) y de
las células estrelladas hepáticas que activan las vías inflamatorias y
fibrogénicas respectivamente~\cite{Feldstein_2003}. Estudios recientes han
demostrado que los hepatocitos esteatóticos activaría distintos
mecanismos moleculares de disfunción hepatocelular que actuarían como un
segundo evento que promueven el aumento de marcadores de inflamación
tales como estrés oxidativo, disfunción mitocondrial, activación de
caspasas proapoptóticas, entre otros~\cite{P_rez_Carreras_2003,Akazawa_2013,Upton_2012}. Más aun,~ éste
daño hepatocelular mediaría la activación~ de células de kupffer y
células estrelladas amplificando de éste modo las cascadas inflamatorias
y fibrogénicas que podrían explicar cómo de una simple esteatosis se
desencadena la EHNA. Por lo tanto, ~a pesar de éstos hallazgo, queda aun
por dilucidar los mecanismos celulares involucrados en la transición de
la esteatosis simple a EHNA.

\textbf{Síndrome de la apnea obstructiva del sueño y su relación con
HGNA}

~~~~ En la búsqueda de nuevos antecedentes que contribuyan a responder
la pregunta ¿Por qué solo algunos pacientes con HGNA progresan a una
forma más agresiva de la enfermadad como la EHNA?, es que observaciones
clínicas han mostrado que tanto pacientes obesos como normopeso que
además poseen síndrome de la apnea obstructiva del sueño (SAOS)
presentan mayor riesgo de padecer una condición más grave de~ HGNA
asociado a niveles elevados en el plasma de marcadores de daño
hepático~\cite{Gude_2009,Shpirer_2010}. La fisiopatología de este cuadro se
caracteriza por la obstrucción intermitente de la vía aérea que altera
el intercambio gaseoso resultando en episodios repetitivos de hipoxemia
(caída en la saturación arterial de oxígeno)~ denominada hipoxia
intermitente crónica (HIC)~\cite{Mirrakhimov_2012}. La evidencia
experimental ha demostrado que la HIC induce daño hepatocelular,
inflamación y fibrosis gatillando la evolución desde el HGNA a EHNA
(AC). Un estudio reciente realizado en pacientes no obesos con SAOS,
demostró que dichos individuos exhiben a nivel histológico un aumento de
marcadores de fibrosis e inflamación que se~ correlaciona con el grado
de severidad del SAOS~\cite{24256086}.~ Más aun, un estudio in vitro
reveló que la condición de hipoxia en hepatocitos desencadena la
disminución de la \selectlanguage{greek}β-\selectlanguage{english}oxidaci\selectlanguage{ngerman}ón de los ácidos grasos y aumento de la
lipogénesis~ de novo, promoviendo la acumulación de lípidos y por ende
explicando la mayor predisposición de hígado graso en éste contexto de
hipoxia y SAOS~\cite{Liu_2014}. Otros estudios clínicos, y estudios
en~ modelos in vivo en los que se ha imitado la HIC, sugieren que en el
contexto del SAOS, el daño hepatocelular y la inflamación hepática
podrían ser de mayor magnitud a través de un mecanismo fisiológico
mediado por la inducción a nivel hepático del factor 1\selectlanguage{greek}α \selectlanguage{english}inducible por
hipoxia (HIF-1\selectlanguage{greek}α\selectlanguage{english})~\cite{Mirrakhimov_2012,Jun_2008}. En base a ello, estudios in vitro
han demostrado que HIF-1\selectlanguage{greek}α \selectlanguage{english}ser\selectlanguage{ngerman}ía determinante en la activación de
moduladores de inflamación y fibrosis hepática, lo cual podría ser clave
para el desarrollo y~ progresión del daño en~ la EHNA
~\cite{Jun_2008,Copple_2010,Moon_2009}. El mecanismo del cómo HIF-1\selectlanguage{greek}α \selectlanguage{english}sensa los niveles de
ox\selectlanguage{ngerman}ígeno intracelulares se debe a que éste factor posee una subunidad
sensible al oxígeno, y~ que a su vez es regulada por la degradación
constante que depende de la acción enzimática de las prolil hidroxilasas
para la posterior degradación proteasomal~\cite{WENGER_2002}. Por lo
tanto, cuando la concentración de oxígeno es baja, la hidroxilación no
se lleva a cabo y HIF se estabiliza y transloca al núcleo para activar
los genes diana por medio de la unión de HIF a los elementos que
responden a hipoxia (HREs) situados en los promotores
\cite{Kim_2006}.

~~~~Por lo tanto, estos antecedentes revelan que la HIC en el contexto
de SAOS estaría involucrada en la transición de una simple esteatosis a
una condición más lipotóxica,~ inflamatoria y/o fibrótica, siendo
considerada como un evento más para inducir EHNA.

\textbf{Microvesículas extracelulares y su rol en la patogénesis del
EHNA}

~~~~ Como se ha descrito anteriormente~ en el contexto del desarrollo de
la EHNA, los hepatocitos esteatóticos al presentar lipotoxicidad
liberarían diversas señales de daño al ambiente promoviendo el
desarrollo de la patogénesis molecular de la EHNA que depende de otros
tipos celulares como las células de kupffer y células
estrelladas~\cite{Povero_2014}. Diversos estudios han identificado como
posibles señales moleculares de daño a las vesículas extracelulares
(EVs) o exovesículas~\cite{Arrese_2015}. Las EVs son pequeñas
estructuras rodeadas de membrana y que se liberan desde las células al
medio extracelular cumpliendo funciones fisiológicamente normales o
estar involucradas en la fisiopatología de alguna
enfermedad~\cite{Colombo_2014}. Las EVs pueden actuar en otras células
diana tanto de forma autocrina, paracrina e inclusive de forma
endocrina~\cite{Eguchi_2015}. Se sabe que el hígado es un productor y
receptor de EVs, y que en modelos in vivo de daño hepático~ se presenta
un aumento de EVs en el plasma \cite{Povero_2014,Arrese_2015}.

~~~~Existen distintos tipos de EVs; los exosomas (50-100 nm) liberados
de cuerpos multivesiculares, las micropartículas o microvesículas
(100-1000 nm) liberadas de brotación de la membrana plasmática y los
cuerpos apoptóticos (\textgreater{} 1000 nm)~\cite{Raposo_2013}. En
general, las EVs pueden contener proteínas, lípidos, DNA y RNA tanto
codificante como no codificante~\cite{Raposo_2013}. Recientes estudios
han indicado que a través de exosomas, los hepatocitos logran
comunicarse con otros tipos celulares activando señales de inflamación,
fibrosis e incluso de carcinogénesis~\cite{Arrese_2015,Eguchi_2015}. Un ejemplo de
ello quedó revelado en un estudio~ in vitro en donde se determinó que la
activación de señales inflamatorias en macrófagos depende de los~
exosomas~ liberados de hepatocitos esteatóticos~\cite{Hirsova_2016}.
Otros estudios in vivo han determinados que el aumento de EVs se
correlaciona con la temporalidad del daño~ en EHNA, por lo que
funcionarían como biomarcadores de ésta patología con un potencial en el
diagnostico no invasivo \cite{Povero_2015,Kornek_2012}.

~~~~ Por lo tanto, la progresión del daño en HGNA depende de una serie
de eventos concomitantes que requieren de la activación de señales de
inflamación y/o fibrosis en el hígado y que no se explica solamente por
la acumulación de lípidos en los hepatocitos y el efecto lipotóxico. Es
por ello, que se propone~ que en el contexto de hipoxia, las EVs juegan
un rol importante en la promoción de una respuesta celular exacerbada
frente a la lipotoxicidad, amplificando paracrinamente los procesos de
inflamación y /o fibrosis en otros tipos de células como las de kupffer
y estrelladas,~ que determinarían el desarrollo de EHNA.

\textbf{HIPOTESIS}

~~~~ La hipoxia induce activación de células de kupffer y células
estrelladas hepáticas a través de EVs (exosomas) liberadas por
hepatocitos esteatóticos.

\textbf{OBJETIVO GENERAL}

~~~~Evaluar si la hipoxia promueve la liberación de las EVs~ desde
hepatocitos esteatóticos~ amplificando las señales inflamatorias y de
fibrosis en células de kupffer y células estrelladas hepáticas
respectivamente.

\textbf{Objetivos específicos}

~~~~1) Evaluar si hipoxia aumenta la liberación de EVs en un modelo~ de
EHNA~ experimental

\selectlanguage{english}- Se evaluara en un modelo in vivo de hipoxia intermitente cronica y
dietetico para la induccion de EHNA

\selectlanguage{english}- Se evaluara en un modelo in vitro de hipoxia quimica con CoCl2 o con
un inhibidor de la prolil hidroxilasa en hepatocitos cargados con AGL
para la induccion de esteatosis y lipotoxicidad

~~~~ 2) Evaluar si las EVs desde hepatocitos esteatoticos en condicion
de hipoxia activan a las celulas de kupffer promoviendo senales
inflamatorias.

~~~~3) Evaluar si las EVs desde hepatocitos esteatoticos en condicion de
hipoxia activan a las celulas estrelladas promoviendo senales
profibroticas.

\textbf{Estrategia Experimental}

Todo el estudio con uso experimental y cuidado de todos los animales
seran revisados y aprobados por el~ Comite de etica y bienestar Animal
(CEBA) de la Escuela de Medicina, Pontificia Universidad Catolica de
Chile.

1. Para evaluar si hipoxia~aumenta la liberacion de EVs en un modelo~ de
EHNA~ experimental:

~\textbf{Modelo~\emph{in vivo}}

Veinticuatro ratones machos C57BL/6 (edad 12 semanas) seran adquiridos
de Jackson Laboratories . Los ratones seran divididos al azar en 4
grupos experimentales (n=6/Grupo). Doce animales recibiran dieta
deficiente en el aminoacido colina~(CDAA) para inducir la EHNA por 22
semanas (Grupo CDAA), de los cuales seis seran sometidos a hipoxia
intermitente cronica (HIC) las ultimas 10 semanas (Grupo CDAA + HIC).
Doce animales recibiran dieta Chow o normal (Grupo Control),~de los
cuales seis seran sometidos a hipoxia intermitente cronica (HIC) las
ultimas 10 semanas (Grupo CHI). Cada grupo de animales se alojara en
jaulas de policarbonato transparente sometidos a ciclos de 12 h de
luz/oscuridad, bajo una temperatura de 21degC y una humedad relativa del
50\%. Despues de las 22 semanas de completado el experimento, los
ratones se sacrificaran por exanguinacion bajo anestesia profunda
intraperitonial (ketamina 60 mg/kg con xilacina 10 mg/kg) , y muestras
de sangre, orina e higado se recolectaran y almacenaran a -80degC hasta su
analisis.~

Para determinar la funcion hepatica de los cuatro grupos, por medio del
plasma recolectado se cuantificara la transaminasa glutamico-piruvica
(GPT) a traves de un kit comercial~ de Kovalent~Ltd. y el contenido de
trigliceridos~hepatico (HTC) se evaluara usando un kit comercial para
mediciones en sangre. ~Para analizar el grado de esteatosis,
balonizacion, inflamacion y fibrosis y obtener el NAS (NAFLD activity
score) de cada uno de los grupos se utilizaran las secciones~ de higado
obtenidas de todos los ~animales. Se realizara cortes histologicos de
cada una de las muestras, los cuales seran tenidos con distintas
soluciones: Hematoxilina/Eosina (HE) para evaluar morfologia y
esteatosis junto a Oil Red para la deteccion de las gotas lipidicas~ y
Sirius Red 0,1\% para evaluar fibrosis a traves de la tincion del
colageno total. Para el calculo del NAS todas las imagenes seran
evaluadas por un examinador ciego.

Para evaluar el aumento de marcadores de inflamacion y fibrosis, se
extraera RNA total desde cada una de las muestras de higado obtenida de
todos los animales para el posterior analisis genico a traves de la
tecnica de RT-qPCR. Los genes a cuantificar seran los correspondientes a
marcadores de inflamacion: IL-1\selectlanguage{greek}β, \selectlanguage{english}IL-6, IL-18, TNF-\selectlanguage{greek}α, \selectlanguage{english}IFN\selectlanguage{greek}γ \selectlanguage{english}y caspasa-1;
y marcadores de fibrosis; Col\selectlanguage{ngerman}ágeno1A, \selectlanguage{greek}α\selectlanguage{english}SMA, MMP-2, TGF-\selectlanguage{greek}β \selectlanguage{english}y CTGF. Adem\selectlanguage{ngerman}ás,
se evaluará la expresión proteica desde cada una de las muestras de
hígado obtenida de todos los animales de HIF-1\selectlanguage{greek}α, \selectlanguage{english}Col\selectlanguage{ngerman}ágeno-I~\selectlanguage{greek}α\selectlanguage{english}2 y
Caspasa-1 a trav\selectlanguage{ngerman}és de la técnica de Western Blot.

Finalmente, la liberación de las EVs se evaluará en plasma y orina
recolectada de cada uno de los animales por ultracentrifugación
diferencial a realizarse en el Laboratorio de Endocrinología en
colaboración con el Dr. Cristián Carvajal. realizarse en el Laboratorio
de Endocrinología en colaboración con el Dr. Cristián CarLas EVs
obtenidas serán cuántificadas y caracterizadas mediante la detección
proteica por Western Blot de los distintos marcadores de la superficie
de las EVs provinientes de hepatocitos tales como LAMP1, CD63, TSG101,
ARF6 y ASGPR1.

\textbf{Posibles problemas del modelo.~}

1. Se considerará el uso de otras dietas para la inducción de la EHNA en
el caso que el daño hepático no sea el que se espera respecto a la
histología y los parámetros evaluados en sangre que miden función
hepática. Las alternativas son el uso de la dieta ~deficiente en
metionina y colina (MCD), que a diferencia de la CDAA, se requiere de
menor tiempo para la inducción de la EHNA (8 a 10 semanas), o el uso de
la dieta alta en grasa (HFD) que presenta una duración similar a la de
la CDAA.

2. Existe variada evidencia respecto a la ~duración de la ~inducción de
la HCI en ratones~\cite{Savransky_2007,Drager_2011}, desde 4 a 24 semanas de
inducción. Es por ello, que se considerará como alternativa un mayor
tiempo de inducción de la HCI (mayor a 10 semanas) en el caso que no se
presente la estabilización de HIF-1\selectlanguage{greek}α \selectlanguage{english}(detectada en h\selectlanguage{ngerman}ígado), cambios
significativos en los parámetros de función hepática y de cantidad de
las EVs a evaluar entre los grupos con HIC y grupo Control con o sin
CDAA. Se estimará además evaluar los niveles de eritropoyetina (EPO) en
sangre como control positivo del efecto de la hipoxia durante las
primeras semanas de la inducción en los animales.

\par\null

\textbf{Modelo~\emph{in vitro}}

Se utilizará la línea celular HuH-7~provenientes de células de carcinoma
hepatocelular humana. Las células HuH-7 se sembrarán en placas de 6
pocillos (para la extracción de RNA total y proteínas) y en flasks de 75
cm2 (para la obtención del medio celular y de las EVs). Para la
inducción química de hipoxia las células serán incubadas durante 24
horas con 200 \selectlanguage{greek}μ\selectlanguage{english}M de Cloruro (II) de Cobalto hexahidratado (Grupo CoCl2)
y alternativamente otro grupo de c\selectlanguage{ngerman}élulas se les inducirá hipoxia a
través del tratamiento con 30 \selectlanguage{greek}μ\selectlanguage{english}M de FG-4497 que corresponde a un
inhibidor de la prolil-hidroxilasa (Grupo iPHD). Las c\selectlanguage{ngerman}élulas sin
tratamiento de CoCl2 o FG-4497 corresponden al Grupo Control. Para la
inducción de esteatosis y lipotoxicidad,~~ las células se tratarán con
una mezcla 2:1 de los ácidos grasos libres (AGL) ácido oleico (AO) 500
\selectlanguage{greek}μ\selectlanguage{english}M y \selectlanguage{ngerman}ácido palmítico (AP) 250 \selectlanguage{greek}μ\selectlanguage{english}M. Se incubar\selectlanguage{ngerman}án las células con los AGL
(Grupo AGL) o coincubarán con CoCl2 (Grupo AGL+ CoCl2)~ o con ~FG-4497
(Grupo AGL + iPHD) por 24 horas. Se realizará 5 repeticiones con los
distintos tratamientos ~para obtener n=5.

Por una parte, los hepatocitos esteatóticos, tras el tratamiento con los
AGL, se caracterizan por un aumento en la~formación de gotas lipídicas.
Esto será evaluado utilizando el reactivo Nile Red que tiñe las gotas
lipídicas de color rojo, pudiendo ser analizadas en un microscopio de
fluorescencia. Por otra parte, los hepatocitos con inducción de hipoxia,
con CoCl2 o FG-4497, ~se caracterizan por estabilizar el factor 1\selectlanguage{greek}α
\selectlanguage{english}inducible por hipoxia (HIF-1\selectlanguage{greek}α\selectlanguage{english}). Para comprobar la efectividad de la
estabilizaci\selectlanguage{ngerman}ón se cuantificarán los niveles proteicos de~HIF-1\selectlanguage{greek}α
\selectlanguage{english}analizados por medio de Western Blot. Se determinar\selectlanguage{ngerman}á cambios en los
marcadores génicos pro-inflamatorios (IL-1\selectlanguage{greek}β, \selectlanguage{english}IL-6, IL-18, TNF-\selectlanguage{greek}α \selectlanguage{english}e iNOS)
y pro-fibr\selectlanguage{ngerman}óticos (Colágeno1A,(Colágeno1A,e \selectlanguage{greek}α\selectlanguage{english}SMA,\selectlanguage{greek}α\selectlanguage{english}SMA,cadacada
MMP-2,MMP-2,unouno PDGF,PDGF,dede TGF-\selectlanguage{greek}β\selectlanguage{english}TGF-\selectlanguage{greek}β\selectlanguage{english}loslos yygruposgrupos
CTGF)CTGF)porpor enmediomedio cadadede unoRT-qPCR.RT-qPCR. de todos los
grupos experimentales por medio de RT-qPCR. Para todos los tratamientos
en las c\selectlanguage{ngerman}élulas HuH-7, se realizará ensayo viabilidad con el reactivo
MTS, en el cual se espera que ninguna de las condiciones afecte el
número de células metabólicamente activas ya que de lo contrario
indicaría un aumento de la muerte celular.

La liberación de las EVs provinientes de las células HuH-7 serán
aisladas a partir de un mínimo de 70 mL de medio de cultivo celular una
vez finalizada las 24 horas de cada uno de los tratamientos por
ultracentrifugación diferencial. Este medio de cultivo puede ser
congelado a -80ºC por un periodo de un mes antes de su análisis, el cual
se realizará en el Laboratorio de Endocrinología en colaboración con el
Dr. Cristián Carvajal. ~Las EVs obtenidas serán cuantificadas y
caracterizadas mediante la detección proteica por Western Blot de los
distintos marcadores de la superficie de las EVs provinientes de
hepatocitos, usando anticuerpos específicos para LAMP1, CD63, TSG101,
ARF6 y ASGPR1.

\textbf{Posibles problemas del modelo.~}

1. Las líneas celulares de hepatocitos como HuH-7 suelen responder a
diferentes tratamientos de la misma forma que un cultivo primario de
hepatocitos. Si no se presentan cambios significativos en la expresión
de los distintos marcadores pro-inflamatorios, pro-fibróticos y en la
liberación de las EVs~con el tratamiento de los distintos
estabilizadores de HIF-1 en las células HuH-7 esteatóticas, se optará
por repetir todos los experimentos usando cultivo primario de
hepatocitos~a partir de ratones machos C57BL/6.

\par\null

~~ 2) Evaluar si las EVs desde hepatocitos esteatóticos en condición de
hipoxia activan a las células de kupffer promoviendo señales
inflamatorias.

Para comprobar si las EVs desde los hepatocitos esteatóticos con y sin
inducción de hipoxia, por medio de los distintos estabilizadores de
HIF-1\selectlanguage{greek}α, \selectlanguage{english}tienen un efecto activador de los macr\selectlanguage{ngerman}ófagos residentes en el
hígado (células de Kupffer o KC) se realizará un cultivo primario de
éste tipo celular a partir de ratones machos C57BL/6 a realizarse en el
laboratorio de gastroenterología de la Universidad de ~Groningen en
colaboración con el equipo del Dr. Han Moshage. ~Una vez obtenido el
cultivo primario de las KC, la activación de las células será evaluada a
partir del tratamiento de ellas con~medio condicionado y con las EVs
aisladas desde células HuH-7 previamente tratadas por 24 horas. ~
Posteriormente, se analizará a nivel génico y proteico por RT-qPCR y
Western Blot respectivamente la activación pro-inflamatoria de las KC a
través de la cuantificación de los siguientes marcadores: IL-1\selectlanguage{greek}β, \selectlanguage{english}IL-6,
IL-18, TNF-\selectlanguage{greek}α \selectlanguage{english}e iNOS. Se realizar\selectlanguage{ngerman}á 5 repeticiones con los distintos
tratamientos (medio condicionado y EVs aisladas de las células HuH-7) en
las KC para obtener n=5.~

~~~~3) Evaluar si las EVs desde hepatocitos esteatóticos en condición de
hipoxia activan a las células estrelladas promoviendo señales
profibróticas.

Para comprobar si las EVs desde los hepatocitos esteatóticos con y sin
inducción de hipoxia, por medio de los distintos estabilizadores de
HIF-1\selectlanguage{greek}α, \selectlanguage{english}tienen un efecto activador de las c\selectlanguage{ngerman}élulas estrelladas en el
hígado (HSC) se realizará un cultivo primario de éste tipo celular a
partir de ratones machos C57BL/6 a realizarse en el laboratorio de
gastroenterología de la Universidad de ~Groningen en colaboración con el
equipo del Dr. Han Moshage. ~Una vez obtenido el cultivo primario de las
HSC, la activación de las células será evaluada a partir del tratamiento
de ellas con medio condicionado y con las EVs aisladas desde células
HuH-7 previamente tratadas por 24 horas. ~ Posteriormente, se analizará
a nivel génico y proteico por RT-qPCR y Western Blot respectivamente la
activación pro-fibrótica de las HSC a través de la cuantificación de los
siguientes marcadores: Colágeno1A, \selectlanguage{greek}α\selectlanguage{english}SMA, MMP-2, PDGF, TGF-\selectlanguage{greek}β \selectlanguage{english}y CTGF.~Se
realizar\selectlanguage{ngerman}á 5 repeticiones con los distintos tratamientos (medio
condicionado y EVs aisladas de las células HuH-7) en las HSC para
obtener n=5.

\selectlanguage{english}
\FloatBarrier
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}

\end{document}

